维生素D3及其结构类似物生物样品分析

  维生素D是人类必需的一种脂溶性维生素，核心功能在于调节钙磷代谢，对维持骨骼、神经和肌肉系统的正常运作至关重要。此外，它还参与组织细胞的分化、增殖以及免疫调节过程。
  临床常用的维生素D及其结构类似物包括：维生素D2、维生素D3、骨化二醇、骨化三醇、阿法骨化醇、帕立骨化醇、卡泊三醇等。
  维生素D结构类似物的生物分析面临显著挑战。部分原因是某些类似物（如骨化三醇）是内源性物质，在人体血浆中天然存在，但其浓度极低（pg级）。如此微量的目标物，加之其他维生素D代谢物可能造成的干扰，使得准确测定这些化合物变得十分困难。
  分析方法的难点
  1)灵敏度挑战
  前处理复杂：为达到极低定量下限（pg级），常需较大血浆样本量（0.3~0.5 mL）。目标化合物的强脂溶性导致仅靠简单蛋白沉淀难以有效纯化，会产生严重基质效应。需采用液液萃取（LLE）、固相萃取（SPE）、蛋白沉淀后吹干再衍生化或其组合等前处理策略。
  离子化效率低：强脂溶性导致其在极性溶剂中溶解性差，难以形成稳定的电喷雾（ESI）带电液滴。其化学结构缺乏强质子化位点，在ESI正离子模式下难以高效生成稳定的[M+H]⁺离子，而更易形成稳定性较差的[M+NH₄]⁺加合物，造成质谱信号波动，严重影响灵敏度和重现性。
  基质抑制显著：强脂溶性使其易受血浆中共萃取的磷脂干扰，产生强烈的离子抑制效应。这不仅大幅降低目标分析物信号（直接影响灵敏度），还可能损害方法的线性范围、准确度和精密度。
  2)内源性干扰
  内源性维生素D代谢物（如维生素D₃及其代谢物）与目标维生素D类似物（如帕立骨化醇）结构式、分子量都非常接近，从而在色谱柱上保留行为高度相似，极易发生共洗脱，很难分离，严重影响目标化合物定量的特异性和准确性。
  3)空白基质难题
  多数维生素D类似物属内源性物质，无法使用常规空白人血浆配制标准曲线，需使用合适的替代基质。方法验证时需同时包含替代基质和真实基质的质控样品（QC），并必须进行平行性实验。只有平行性实验通过，才证明替代基质适用于定量分析。
  4)稳定性问题
  维生素D类似物普遍存在显著的光不稳定问题。因此，从全血采集、样品前处理、储存到最终分析的所有环节，均须严格避光操作（如使用棕色容器、在黄光环境下操作），以确保分析物的稳定性。
  方法基本信息
  实验室采用蛋白沉淀或液液萃取前处理方式，找到最佳的流动相及色谱柱实现基质干扰分离，已成功开发出该类物质的LC-MSMS检测方法，测定人血浆或血清中维生素D3及其多个类似物，可以快速高效的完成临床生物样品分析检测，助力药物BE研究及临床PK或其他检测研究。其中维生素D3定量下限为0.5 ng/mL，帕立骨化醇、卡泊三醇、艾地骨化醇的定量下限分别为为10、20和10 pg/mL。定量下限的典型图谱如下：
  维生素D3（定量下限：0.5 ng/mL）
  T(min)
  帕立骨化醇（定量下限：10 pg/mL）
  T(min)
  卡泊三醇（定量下限：20 pg/mL）
  T(min)
  艾地骨化醇（定量下限：10 pg/mL）
  T(min)
  研究经验
  维生素D3的方法已经成功用于阿仑膦酸钠维D3片人体BE研究并完成检测，帕立骨化醇的方法成功运用于帕立骨化醇软胶囊人体BE研究，卡泊三醇的方法成功运用于卡泊三醇倍他米松软膏人体PK研究并完成申报资料提交。
  作为国内首批运用电子化管理的检测单位，湖南科锐斯医药科技有限公司自2020年起在项目管理、物资管理、原始记录、档案管理等全面运用电子化平台开展生物样本检测研究。公司拥有生物样本分析检测、外用制剂体外评价、制剂微观结构解析及辅料反向等系列平台，目前已完成近500个品种的生物样本检测，申报项目300+项，接受国家局现场核查近40次且0缺陷通过，70+个品种免核查。
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  特色品种
  内源性物质：熊去氧胆酸、维生素D3及类似物
  外用制剂：洛索洛芬钠凝胶贴膏、氟比洛芬凝胶贴膏等
  复方制剂：复方甘草酸苷等
  体外磷结合剂：枸橼酸铁等
  参考文献
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  [3]Spanaus,Katharina,and A.Von Eckardstein.Evaluation of two fully automated immunoassay based tests for the measurement of 1α,25-dihydroxyvitamin D in human serum and comparison with LC-MS/MS.Clinical Chemistry and Laboratory Medicine,2017,55(9):1305-1314.
  [4]ICH M10 2022生物分析方法验证及样品分析.